Resumo de Transformação Genética de Sorgo Utilizando o Bombardeamento de Partícu - Rosângela Luci Brandão; Andréa Almeida Carneiro; Newton Portilho Carneiro; Robert Eugene Schaffert; Luciano Paiva; Gracielle Teodora da Costa Pinto Coelho

    Transformação por Biobalística.

    A técnica de biobalística consiste na inserção de micropartículas de ouro ou tungstênio, revestidas com DNA de interesse, no núcleo de plantas. Uma vez dentro da célula, a construção gênica pode-se integrar no genoma da planta. As micropartículas podem ser aceleradas por gás comprimido (hélio), com velocidade suficiente (1.500 km/h) para penetrarem as células de um tecido alvo. Esse processo ocorre no interior de uma câmara sob vácuo, para evitar que o ar provoque a desaceleração das micropartículas.

    Construção Gênica.

    O material genético utilizado necessita ser clonado em um vetor, amplificado e purificado de maneira cuidadosa, para render DNA concentrado de alta qualidade. Geralmente, são utilizados plasmídeos bacterianos como vetores na clonagem do gene de interesse.
     Os plasmídeos bacterianos são independentes do DNA cromossômico, capazes de autorreplicação; por isso, são facilmente manipulados no processo de transformação genética. É necessário ter um gene “de interesse” que pode estar relacionado com a resistência ou maior tolerância a algum tipo de estresse biótico ou abiótico, com a melhoria da qualidade nutricional, acoplado a um promotor que controle sua expressão temporal e espacial. Há a necessidade de um gene marcador de seleção, quando a característica de interesse não é auto-selecionável, e um gene-repórter durante o período de otimização do protocolo de transformação genética.
    Os genes marcadores são utilizados na seleção e são responsáveis por codificar uma proteína com atividade enzimática ou um produto que irá conferir às células transformadas da planta resistência a um determinado substrato. Esses genes marcadores permitem que apenas as células transformadas cresçam, em detrimento das células não-transformadas. Depois da transformação, as células transgênicas estão em número muito reduzido, quando comparadas com as não-transgênicas, sendo necessária uma metodologia de seleção para proporcionar o crescimento preferencial das células transformadas.
    Os genes-repórteres são aqueles que codificam para uma proteína não tóxica, cujo produto é facilmente detectável e não é produzido normalmente pelas plantas. Possibilitam a identificação ou marcação das células transformadas, sem eliminar as células não-transformadas. Funcionam como gene complementar ao gene de seleção. Geralmente, sua expressão transiente é utilizada na fase de otimização dos processos de transformação genética. São também muito utilizados em estudos de regulação e função gênica.

    Parâmetros Físicos Relacionados ao Aparelho a Ser Utilizado.

    Variações da pressão do gás hélio, o nível do vácuo gerado, o tamanho e o tipodas partículas utilizadas e a posição do tecido-alvo dentro da câmara de bombardeamento são parâmetros físicos importantes no transporte do conjunto micropartícula/DNA para dentro do tecido-alvo. Esses processos devem favorecer a penetração do DNA dentro das células e, ao mesmo tempo, minimizar as injúrias ou estresses que o tecido vegetal possa sofrer.

    Parâmetros Relacionados aos Microprojéteis.

    O tipo e o tamanho da micropartícula são características importantes, uma vez que determinarão a sua profundidade de penetração e aceleração. As micropartículas mais utilizadas em bombardeamento são de tungstênio ou de ouro.
    As micropartículas de tungstênio podem ser obtidas de vários tamanhos e são extremamente irregulares.  As partículas de ouro são mais redondas e uniformes.

    Parâmetros Biológicos.

    Tecido vegetal - pode ter um efeito significante na freqüência e no sucesso dos eventos de transformação e, especialmente, no número de plantas recuperadas. Explantes utilizados para o bombardeamento de partículas e recuperação de plantas transgênicas devem ser capazes de receber e integrar o DNA, passar por um processo de seleção para recuperação de células transgênicas e regenerar plantas férteis e fenotipicamente normais. A eficiência do processo de regeneração do tecido-alvo precisa ser alta para a obtenção de plantas transgênicas. Tecidos embriogênicos e meristemáticos são os mais empregados na produção e recuperação de plantas transgênicas. Tais culturas consistem de tecidos que estão rapidamente proliferando onde uma grande quantidade de células totipotentes estão disponíveis para serem bombardeadas. As condições exatas requeridas na cultura de tecidos para gerar tecidos embriogênicos e meristemáticos de alta qualidade, variam entre espécies e até mesmo entre genótipos dentro de uma mesma espécie e precisam ser empiricamente determinadas. Enquanto algumas cultivares dentro de uma espécie respondem muito bem às técnicas de cultura de tecidos e produzem tecidos de alta qualidade para a integração do transgene, a maioria permanece difícil de manipular. A escolha do tecido-alvo apropriado e o estado fisiológico do material vegetal, antes e após o bombardeamento, são críticos para a regeneração de transformantes estáveis. Portanto, o desenvolvimento de protocolos para a obtenção de tecidos totipotentes, através de cultura de tecidos, é um dos componentes centrais dos programas de transformação genética de plantas.
    Concentração osmótica – A adição de um agente que aumente a osmolaridade do meio de cultivo durante o bombardeamento pode aumentar as taxas de transformação. O aumento da concentração osmótica atua causando plasmólise das células, o que diminui a perda de protoplasma em células que são penetradas pelas partículas.

    Transformação Genética de Sorgo via Biobalística.

    O protocolo de transformação genética, via biobalística, de sorgo da linhagem CMSXS 112B, foi desenvolvido no laboratório de Biologia Celular e Cultura de Tecidos da Embrapa Milho e Sorgo.
     Iniciamos com a produção de calos embriogênicos de sorgo. Seguimos com a precipitação do DNA sobre as micropartículas de tungstênio, pela adição de etanol e CaCl2.
    Na seleção das células transformadas, o glufosinato de amônia é utilizado em nossas construções gênicas como o gene marcador de seleção.
    Após a regeneração de plantas de sorgo, finalizamos com a identificação das plantas transgênicas.
    O isolamento de DNA genômico é baseado no método de Saghai-Maroof et al. págs. 81:8014-8018, com modificações.

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