Resumo de Prtocolo pesquisa Bacterias Coliformes segundo NP 2164 -

São consideradas os principais indicadores de contaminação fecal.
Todas as bactérias coliformes são gram-negativas manchadas, de hastes não esporuladas que estão associadas com as fezes de animais de sangue quente e com o solo.
Grupo de bactérias constituído por bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, capazes de crescer na presença de sais biliares, com propriedades similares de inibição de crescimento, e que fermentam a lactose com produção de aldeído, ácido e gás a 35ºC em 24-48 horas. O grupo inclui os seguintes géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebisiela.

As Coliformes fecais são coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas.

OBJECTIVO: Este método tem como objetivo a detecção de coliformes (totais e fecais) em amostras de alimentos, através do teste de presença-ausência (de gás).
RESUMO:Inicialmente, prepara-se uma amostra do alimento, a qual consiste numa suspensão 1:10. Segue-se a realização de sucessivas diluições decimais da suspensão. O número de diluições efectuadas depende da previsão da quantidade de bactérias portadas pelo alimento nas condições em que está a ser analisado (quanto maior for essa previsão, maior deverá ser o número de diluições).
Para averiguar a presença de bioindicadores de contaminação fecal no alimento analisado, inoculam-se alguns ml das suspensões num meio de Verde-Brilhante com o qual, se existirem, os bioindicadores irão reagir.
MATERIAL:

Micro pipetas
Varetas
Tubos de ensaio
Ansa de platina
Erlenmeyer
Estufa
Hote
Balança digital
Aparelho para determinação pH
Homogeneizador
Lamparina
Algodão
Álcool
Água destilada
Diluentes
Meio de Verde - Brilhante com concentração dupla
Meio de Verde - Brilhante com concentração normal

Preparo de Caldo Verde Brilhante
Triptona
Lactose
Bílis de boi desidratada Verde brilhante
Agua

Concentração normal
1 litro de água destilada para
40gr de meio

Concentração dupla
1 litro de água destilada para
80gr de meio

Certificar antes da utilização que os tubos de Durhan estão completamente imersos no meio de cultura e livres de bolhas

Composição
Extracto de carne
Lactose
Peptona
Água destilada

Concentração normal
1 litro de água destilada para
13gr de meio

Concentração dupla
1 litro de água destilada para
26gr de meio

Obs: Encontra-se á venda no mercado

Triptona (Peptona tripsica de caseína)
Cloreto de sódio
Agua destilada

Dissolver os componentes na agua destilada, aquecendo até a ebulição se necessário.
Ajusta-se o pH de modo a que depois da esterilização seja 7,0 a 25cº
Distribui-se em volumes de 100cm3 ou de 9cm por tubos de 20mm x 20mm.

Solução de Ringer a ¼ (diluente para leites e produtos lácteos)

Composição
Cloreto de sódio Monoidrogenocarbonato de sódio
Cloreto de potássio
Cloreto de cálcio
Agua destilada

Dissolver os componentes na agua destilada, aquecendo até a ebulição se necessário.
Ajusta-se o pH de modo a que depois da esterilização seja 7,0 a 25cº
Distribui-se em volumes de 100cm3 ou de 9cm por tubos de 20mm x 20mm.
Esteriliza-se em autoclave a 121Cº durante 15 min.

PROCEDIMENTOS DE ESTERILIZAÇÃO

Todos os intervenientes da deverão lavar bem as mão antes de contacta com qualquer instrumento e passá-las por álcool durante os procedimentos que manifestem potencial risco de contaminação sobre o alimento em análise.

Todo o material utilizado, incluindo os meios, nesta experiência deverá de ser devidamente esterilizado.

Qualquer procedimento que envolva o contacto dos alimentos, suspensões, diluições e meios com a atmosfera laboratorial deverá ser realizado próximo da chama do bico de Bunsen.

PREPARAÇÃO DE SUSPENSÃO (1:10)
Na hote, coloque próximo da chama a balança e, sobre ela, um Erlenmeyer.
Tare a balança e obstrua o gargalo do balão com algodão.
Coloque o alimento perto da chama e corte, com um bisturi, pequenos pedaços do alimento em diferentes zonas da sua superfície e do seu interior e insira-os, utilizando uma pinça, no balão até que a balança marque um valor , preferencialmente, próximo dos 10 gr.
Adicione 9ml de diluente.
Com a vareta, agite a suspensão durante algum tempo.
Registe, no exterior do balão, com um marcador, a referência do alimento e a sua diluição (10-1, neste caso).

DILUIÇÕES DECIMAIS
Com a micropipeta, sempre próximo da chama, transfira 1ml de suspensão para um tubo de ensaio devidamente esterilizado e preenchido com 9ml de diluente.
Obstrua o gargalo do tubo de ensaio com algodão e agite no homogeneizador a diluição obtida durante algum tempo.
Registe, no exterior do tubo de ensaio, com um marcador, a referência do alimento e a sua diluição (10-2, neste caso).
A partir desta diluição, repita os mesmos procedimentos para obter a seguinte (10-3), e assim sucessivamente até completar as diluições necessárias.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Junto à chama, inocule, auxiliado pela micro pipeta, 10ml (correspondente a 1gr de alimento) da suspensão num tubo de ensaio com 10ml de meio de Verde - Brilhante a concentração dupla e obstrua o gargalo do tubo de ensaio com algodão.

Incube o tubo de ensaio a 37ºC durante 48 horas.

RESULTADOS
Após a incubação, há dois resultados observáveis:

Negativo – Não se verifica qualquer alteração no meio de Verde-Brilhante - o alimento a ser analisado não possui bactérias coliformes. (Não realizar os procedimentos seguintes)
Positivo – O meio apresenta-se ligeiramente enturvado e é visível a presença de gás no tubo interior – o alimento analisado possui bactérias coliformes.

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